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DNA甲基化能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是最重要的表观遗传调控方式之一，与基因的表达和调控密切相关。DNA甲基化在基因印迹、胚胎发育、X染色体基因沉默和细胞周期调控等生理和病理过程中发挥着重要作用。常用的检测DNA甲基化的方法是亚硫酸氢盐转化法。这项技术原理是利用亚硫酸氢盐处理DNA，可使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。转化后，DNA的甲基化情况可以通过PCR扩增或DNA测序来判定。

本制品将DNA变性与亚硫酸氢盐转化合并为一步，可以100min完成对DNA样品的转化，其中未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的转化率高达99%以上。DNA投入量范围为100pg～2μg，转化后的产物适用于甲基化特异性PCR、qPCR检测和NGS建库测序等下游应用.

• 转化效率高：未甲基化的胞嘧啶转化效率≥ 99%；
  
• 兼容范围广：可高效转化动物、植物细胞或组织提取的DNA、cfDNA等；
  
• 投入量兼容范围广：可兼容投入量范围为100pg～2μg的DNA。

• 试剂准备：
  
  • 自备材料：无水乙醇、Nuclease-free ddH2O、1.5mL Nuclease-free离心管、Nuclease-free PCR管、Nuclease-free枪头、PCR仪、离心机、涡旋仪。
    
  • 根据实验需求配制CT转化混合液。配制时，每管CT转化试剂干粉中需加入900μL Nuclease-free ddH2O，270μL稀释缓冲液和60μL溶解液，上下甩动混匀3～5次，室温下涡旋震荡5～10min左右，直至完全溶解。
    
    • 每管混匀后的CT转化混合液可进行10次反应。
      
    • CT转化混合液推荐现用现配，若无法一次性全部使用，可于0～4℃保存1周，-15～-30℃下保存一个月。使用前需充分复溶，平衡至室温后涡旋混匀使用。
  • 漂洗液首次使用前需加入指定体积无水乙醇。
    
    6mL漂洗液中加入24mL无水乙醇；24mL漂洗液中加入96mL无水乙醇。
    
• 亚硫酸氢盐转化：
  
  • 在200μL PCR管中加入50～500ng DNA样品，若体积不足20μL，加ddH2O补足至20μL，充分混匀。
    
    本试剂盒起始基因组DNA的用量为100pg～2μg。为了获取最佳的转化效果，推荐起始基因组DNA的使用量为50～500ng。
    
    
  • 向上述PCR管中加入130μL CT转化混合液充分温和混匀，并按照下列程序进行反应：
    

    温度	时间
    98℃	10min
    64℃	90min
    4℃	-

    • 反应过程中，应保证盖紧EP管的帽子，并进行热盖处理。
      
    • PCR仪设置的加热体积为≥100μL即可。
• 转化产物纯化：
  
  • 向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入600μL结合缓冲液。
    
  • 将转化后的反应液震荡混匀，短暂离心后转移至含有结合缓冲液的吸附柱中，吹打混匀，盖紧盖子后上下颠倒混匀6～8次，使转化产物与结合缓冲液完全混匀。12000rpm (13400×g)离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
    
  • 加入100μL漂洗液到吸附柱中，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
    
    请在首次使用前在漂洗液中加入相应量的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记，密封于室温保存。
    
    
  • 向吸附柱中加入200μL去磺化缓冲液，室温放置15～20min，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
    
    去磺化缓冲液中含有机试剂，勿长时间开盖放置。
    
    
  • 加入200μL漂洗液到吸附柱中，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
    
  • 重复操作5。
    
  • 将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心1min，除去残留的漂洗液。
    
  • 将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，吸取10μL洗脱缓冲液直接加入柱基质中，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。
    
    洗脱体积可以＞10μL，但较小的洗脱体积可以提高DNA浓度。处理后的DNA建议立即检测，如需保存更长时间则建议保存在-20℃或更低温度下(-70℃)。另外，在后续的PCR扩增反应中，建议每次使用1～4μL洗脱的DNA，最多可以使用10μL。

• DNA回收率较低
  
  • 结合不充分：确保结合缓冲液与转化后的产物充分混匀。
    
  • 洗脱液不合适：洗脱缓冲液的pH值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱，请确保其pH值＞7.5，pH值过低可能导致低洗脱效率。
    
  • 洗涤液乙醇含量不足：确保加入指定体积的无水乙醇，使用后未及时盖严瓶盖，防止乙醇挥发。
    
  • 起始的DNA质量较差：确保DNA的A260/280比率在1.7～1.9凝胶电泳的DNA条带清晰，无降解。
    
  • 去磺化缓冲液有机溶剂含量不足，使用后未及时盖严瓶盖。
    
  • 脱硫反应时间过长，超过20min。严格控制脱硫反应步骤时间，最长不要超过20min。
• DNA转化率低
  
  • CT转化混合液失效：重新配制新鲜的CT转化混合液，并在有效期内使用。
    
  • 起始基因组DNA不纯或者使用量过多：确保DNA的A260/280比率在1.7～1.9，而且基因组DNA的用量不宜过多，造成CT转化不充分。
    
  • 投入的DNA样本GC含量高：可适当的延长转化时间。
    
  • 脱硫步骤操作不当：CT转化产物纯化过程中，需要去磺化，请严格按照说明书要求加入相应量的去磺化试剂和保证充足的去磺化时间。